Reagensek összetétele
Reagens 1: Sodium salicylate 120 g/L Sodium citrate 120 g/L Sodium nitroprussiate * 2 H2O 0.925 g/L Reagens 2: Sodium hydroxide 32 g/L Dichloroisocyanuric acid Sodium salt * 2 H2O 2 g/L
Alkalmazási területek
Ezt az eljárást fermentlé ammónium-ion tartalmának meghatározásához használtam, de természetesen vizek, tápoldatok mérésére is kiválóan alkalmazható.
Az E.coli fermentációknál fontos ismerni az ammónium-ion koncentrációját, mivel a sejtek ebből építik fel aminosavaikat, DNS, RNS, stb. állományukat. Ennek hiányában nem képesek tovább osztódni és természetesen, ha pl. valamilyen fehérje vagy aminocukor a kívánt termék, amit termeltetünk velük, akkor ezek színtézise is megáll. A túl nagy koncentrációban jelenlévő ammónium-ion szintén károsan befolyásolja a sejtek növekedését és a termeltetett célfehérje, szénhidrát koncentrációja is csökken. Ha csak közelítőleg akarjuk meghatározni az ammónium koncentrációt akkor használhatunk gyorstesztet. Katt ide!
A recept
- Eppendorf csőben centrifugáljunk le 1mL fermentlevet 14.000-es fordulaton 12percig
- A felülúszót (supernatant) hígítsuk meg desztillált vízzel, hogy a koncentráció 0 és 50mg/L közé essen
(ebben az esetben 200x-es hígítás volt a megfelelő, de ez ugye erősen függ a körülményektől)- 50uL mintát és 100-100µL reagens 1-et és 2-őt belepipettázzuk egy küvettába és 15percig állni hagyjuk. A zöld szín erősödése jelzi az ammónium-ion jelenlétét.
- 15perc eltelte után 1,5mL desztillált vízzel meghígítjuk, majd mérjük az abszorbanciát 658nm-en
A kalibrációs sorozat elkészítése
A kalibrációs sorozat elkészítéséhez ammónium szulfátot használunk (használható egyéb ammónium só is, pl. klorid, vagy hidrogén foszfát). Első lépésben készítünk egy kb. 0,5g/L koncentrációjú törzsoldatot, amit a megfelelő értékekre hígítunk, 
hogy az egyes törzsoldatok koncentrációja 5,10,15,30,50,mg/L legyen ammónium szulfátra nézve. Ezeknek az abszorbancia értékeit és moláris koncentrációit az alábbi táblázat tartalmazza és a jobboldali grafikonon ábrázolva is láthatjuk.
(NH4)2SO4 µM NH4+ Absorption at 658nm 5mg 75,55 0,0487 10mg 151,11 0,0929 15mg 227,22 0,1323 30mg 453,88 0,2782 50mg 756,66 0,4415
Az alábbi táblázat tartalmazza a leolvasott abszorbancia értékekhez tartozó koncentrációkat. Pl. az első mintában a mért abszorbancia 0,0652, az ehhez tartozó koncentráció érték 103,54 µM/L. A mintát, úgy készítettem, hogy 0,5mL fermentléhez 1mL vizet adtam, majd 20percig 100oC-on tartottam, hogy a sejten belüli ammónium-ionok kiszabadulhassanak, tehát ez egy 3-szoros hígítás. Centrifugálás után a felülúszóból 50µL-t 10mL-re hígítottam egy mérőlombikba, ez tehát egy további 200-szoros hígítás. Így kaptuk az átszámítási faktort, ami (103,54*200*3)/1000000. Az egymilliós osztás a µM –> M átszámítás miatt kell.
Az egyes abszorbancia értékekhez tartozó koncentrációk
| Minta fermentáció | ||||||||||||
| Minta | Idő (h) | OD | Abszorbancia 658nm-en | NH4+ µM higított mintában | Koncentráció [mol/L] | Koncentráció [g/L] | ||||||
| 1. | 22 | 51,53 | 0,0652 | 103,5348 | 0,062121 | 1,118176 | ||||||
| 2. | 41,53 | 98,62 | 0,0516 | 80,17388 | 0,048104 | 0,865878 | ||||||
| 3. | 46,08 | 105,02 | 0,0543 | 84,81171 | 0,050887 | 0,915966 | ||||||
| 4. | 65,42 | 131,3 | 0,0797 | 128,4416 | 0,077065 | 1,38717 | ||||||
| 5. | 70,33 | 136,48 | 0,0761 | 122,2579 | 0,073355 | 1,320385 | ||||||
| 6. | 94,67 | 150,98 | 0,0905 | 146,993 | 0,088196 | 1,587524 | ||||||
| 7. | 114,33 | 199,44 | 0,0994 | 162,2806 | 0,097368 | 1,752631 | ||||||
| 8. | 137,17 | 174,92 | 0,11 | 180,4884 | 0,108293 | 1,949275 | ||||||
Excel file letöltése
