Fág teszt

Egy kis bevezető

Bakteriofágnak nevezzük a baktériumokat fertőzni képes vírusokat. Gyakran röviden csak fágként említik őket. Sejtélősködők, önmagukban életképtelenek, de gazdaszervezet nélkül az aktivitásukat évtizedekig képesek megtartani. Egy tipikus bakteriofág egy külső fehérjeburokból (kapszid) és az ebben elhelyezkedő genetikai állományból áll, ami lehet DNS vagy RNS típusú. Mindenhol megtalálhatóak, a levegőben, a talajban, baktériumokban. Becslések szerint a fágok a legszéleskörűbben elterjedt, legváltozatosabb szervezetek a földi bioszférában.

Legtöbbünk aki természettudományos területen tanul, csak érintőlegesen foglalkozik és a legtöbb esetben gyakorlatilag nem “találkozik” fágokkal. Ez velem sem volt másképpen. Azon kívül, hogy ismertem a felépítésüket tulajdonságaikat, gyakorlati hasznosságukat, meg, hogy tudnak kellemetlenségeket okozni nem gondoltam volna, hogy ennyire durva lesz. Évekig dolgoztam mindenféle E.coli törzsekkel, néhány millilitertől 20 literig, bármiféle fág fertőzéstől mentesen, mígnem egy reggelen (az inokulálás, vagyis a beoltás másnapján) azt láttam, hogy a pO2 szint a kezdeti csökkenés (ahogy nőnek a sejtek egyre nagyobb az oxigén igény) után hírtelen megemelkedett, ami a sejtek gyorsan bekövetkező tömeges pusztulására utal. Lásd a grafikonon alább. Az x tegely felirata egyel el van csúszva, úgyhogy a világoskék vonal mutatja a pO2-t, a barna pedig a keverő sebességét. Jól látható, hogy a pO2 az első 6,5 órában csökken, majd stagnál, végül hirtelen megnő.

phage

Ez a tünet előfordulhat akkor is, ha valamilyen létfontosségú komponensre limitált a média, így első körben mi is erre gyanakodtunk, majd egyre többször fordult elő, volt, hogy 4 fermentációból 3 elpusztult. Ekkor vált világossá, hogy mivel is van dolgunk. Kezdetben csak alkoholt használtunk a felületek fertőtlenítésére, ami a fágok ellen nem hatásos, ezért gyorsan váltottunk Virkon-ra (ez egy peroxo-monoszulfátot tartalmazó erős oxidálószer), ami minden lehető mikroorganizmust elpusztít. Végül komoly laboratóriumi higiéniai szabályokat bevezetve fél év alatt teljesen elimináltuk a fágokat, vagyis inkább nagyon visszaszorítottuk őket, mert néha napján azért felütik a fejüket.

Kimutatásuk

Szükséges eszközök és anyagok

Exponenciálisan szaporodó E.coli tenyészet
(ami előzőleg nem érintkezett fággal )
Fedő agar Termosztát
Minta a fág gyanús fermentációból. Steril 2,5mM calcium-klorid oldat (CaCl2) Centrifuga
LB-agar plétek (a megfelelő antibiotikumokkal,
ha szükséges)
Vízfürdő

 

 

A fedő agar elkészítése

Keverj össze 3:1 arányban LB-agart és 2,5mM-os CaCl2 oldatot, autoklávban sterilizáld majd tartd 45oC-on a felhasználás idejéig, hogy megelőzd a megdermedését.

 

A kísérlet menete

  1. Készíts tenyészetet fagyasztva tárolt mintából, vagy plétről származó E.coli-ból LB-glükóz médiumban. 1 éjszaka 37oC.
  2. Másnap mérd meg az OD-jét a tenyészetnek, majd indíts egy második tenyészetet, hogy a kezdeti OD-ja 0,01 legyen, tedd az inkubátorba 3-5 órára. Ha az OD 0,5-1 között van, mehet a következő lépés.
  3. Legkevesebb 1 órával a felhasználás előtt vedd ki az előzőleg elkészített LB pléteket, majd helyezd 37oC-os inkubátorba.
  4. A 50 oC tartott fedőagart 2ml-éhez adj 100uL (OD 0,5-1) tenyészetet, értelem szerűen, ha több plétet készítesz akkor 20ml-hez 1 mL-t. Óvatosan keverd össze, elkerülve a buborék képződést.
  5. Pipettáz 2-2 millilitert az egyes LB plétek tetejére, majd hagyd megdermedni (min. 10 perc), a felhasználásig szobahőmérsékleten fejjel lefelé fordítva tárold.
  6. A fág gyanús fermentációból vegyél mintát, centrifugáld le majd felülúszóból csinálj 100, 1000, 10000 szeres hígítást a 2,5mM-os CaCl2 oldattal, jól keverd össze, elkerülve a buborék képződést.
  7. A fedőagarral elkészített plétet oszd négy részre, majd egy húsz mikroliteres pipettával 5-10 helyen az egyes negyedekben érints meg az agar felületét közben apránként adagold az oldatot, először hígítatlan, majd a 10-2, 10-3, 10-4 hígítású mintákkal. Készíts egy referencia plétet is amire csak tiszta CaCl2  oldatot pipettázz. Hagyd, hogy a cseppek beszívódjanak, majd parafilmezd le és fejjel lefelé rakd a 37oC os termosztátba.
  8. Másnap vizsgáld meg a pléteket, a tiszta területek jelenléte jelzi a fág fertőzöttséget, lásd a képeket alább.
  9. Ne nyisd ki a pléteket, a hígitási sort és a fermentlevet körültekintően semmisítsd meg elkerülve a fágok további terjedését.

 

Fág teszt

Share This:

 
Loading Facebook Comments ...

Leave a Comment