Az Escherichia coli (kólibaktérium vagy kólibacilus) egy rövid, Gram-negatív baktérium az Enterobacteriaceae családban, az Escherichia nemzetség legismertebb faja. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan is. Aerob, fakultatív anaerob.

Gyakorlati megközelítés

Az egyetemen sokszor elméleti oldaláról közelítjük meg a gyakorlatban amúgy sokkal érthetőbben demonstrálható kérdéseket. Az alábbiakban összegyűjtöttem a legfontosabb gyakorlati lépéseket, amivel könnyedén meghatározhatjuk, jelen esetben az E.coli-ra jellemző növekedési paramétereket.

OD₆₀₀ (optical density) – Sejtkoncentrációt kifejező érték. Viszonyszám, mértékegysége nincs. 0 tól akár több száz is lehet. Egy OD₆₀₀érték körülbelül 8 x 10⁸sejt/ml értéknek felel meg.

Sejtszám – OD értékből számolható. [db]

Generációs idő – az az idő, ami alatt a biomassza tömege a 2 szeresére nő.

Növekedési ráta – Az egyed szám időegység alatti növekedését mutatja.

Generációk száma – Optimális környezetben a sejtszám időegység alatt megduplázódik. 1, 2, 4, 8, stb. vagy 2⁰, 2¹, 2², 2³………2ⁿ (ahol n = generációk száma)

Mindez a gyakorlatban

A baloldalon agar minimál médiumon tenyésztett e-coli látható, szépen elkülönült telepekkel. Ezekből kiválasztunk egyet oltókaccsal felvesszük, a jobb oldalon látható falcon csőben lévő médiumba elszuszpendáljuk, majd rázó inkubátorba tesszük (28-33^oC) éjszakára.

→

Ha mindent jól csináltunk akkor reggelre egy zavaros oldatot kapunk, ennek megmérjük az optikai sűrűségét. 100μL kiveszünk, 900μL izotóniás sóoldattal hígítjuk (10x hígítás), majd spektrofotométerrel 600nm-en megmérjük az OD-t. OD₆₀₀ = mért érték * hígítás, ez többnyire 1-2,5 érték között lesz.

Ebben az esetben az OD = 2.00

Képek

[Best_Wordpress_Gallery id=”49″ gal_title=”shake flask”]

Ebből az oldatból 2-2ml-t 18-18ml friss médiumba oltunk (10x), az egyik 28^oC-ra másikat 33^oC-ra tesszük. Óránként mérjük az OD₆₀₀ értéküket. Az értékeket grafikonon ábrázoljuk.

Idő [h]	OD₆₀₀	Sejtszám	log(sejtszám)	33^oC 〈〉 28^oC	OD₆₀₀	Sejtszám	log(sejtszám)
0	0,2	160000000	8,20412		0,2	160000000	8,20412
1,17	0,3	240000000	8,380211		0,25	200000000	8,30103
2,33	0,4	320000000	8,50515		0,4	320000000	8,50515
3,33	0,7	560000000	8,748188		0,55	440000000	8,643453
4,33	1,1	880000000	8,944483		0,8	640000000	8,80618
5,17	1,6	1,28E+09	9,10721		1,05	840000000	8,924279

OD₆₀₀ az idő függvényében.

Az y tengely bal oldalán a sejtszám logaritmusa, a jobb oldalon a sejtszám van ábrázolva.

Generációs idő

G = t/(3,3log(N/N₀))

Ahol:

	28^oC	33⁰C
G = generációs idő [h]	2,18	1,73
t = két mintavétel között eltelt idő [h]	5,17	5,17
N = Időintervallum végén mért OD	1,05	1,6
N₀ = Időintervallum kezdetén mért OD	0,2	0,2

Látható, hogy 33 ⁰C-on gyorsabban nőnek a sejtek.

Növekedési ráta

μ = ln(N/N₀)/t

	28^oC	33⁰C
μ = Növekedési ráta h^-1	0,32	0,40
t = két mintavétel között eltelt idő [h]	5,17	5,17
N = Időintervallum végén mért OD	1,05	1,6
N₀ = Időintervallum kezdetén mért OD	0,2	0,2

Generációk száma

n = t/G

	28^oC	33⁰C
n = Generációk száma	2,37	2,99
t = két mintavétel között eltelt idő [h]	5,17	5,17
G = generációs idő [h]	2,18	1,73

Számolási feladat

Van egy kiindulási sejtenyészetünk OD₆₀₀ =2,00. A fentiekben meghatároztuk a jellemző paramétereit. Az a feladatunk, hogy ebből egy éjszakás tenyészetet indítsunk, aminek az OD₆₀₀ értéke reggelre 2,5 kell legyen, ez 17 órát jelent. A tenyészetet 28⁰C-os inkubátorba tesszük, a térfogata pedig 20mL. Ezzel fogjuk majd inokulálni (beoltani) a 2L-es fermentorunkat.

N = N₀ * e^μ*t

Amit ismerünk ebből:

N = 2,5

μ = 0,32h^-1

t = 17h

Átrendezve az egyenletet:

N₀ = N/e^μt= 2,5 / e^0,3217= 0,0108 ∼ 0,011

Tehát a 20mL médiumhoz annyi ml OD: 2,00 inoculumot kell adni, hogy a kezdeti OD értéke 0,011 legyen. Ez így ránézésre kb. 200-szoros hígítást jelent.

Pontos értéket egy egyszerű hígítási egyenlettel ki tudjuk számolni (ahol X1 OD:2,00 inokulum millilitereinek a száma):

X₁ * 2 = 20ml * 0,011, X₁= 0,11ml

Ahhoz tehát, hogy a kezdeti OD értéket 0,011 re állítsuk be, a 20ml kiindulási oldatunkhoz 0,11ml (OD:2,00) inokulumot kell adnunk, ami 182,82 szeres hígítást jelent.

A számításhoz használhatod az online kalkulátort is:

http://weblaboratorium.hu/html/2.php

Ha jobban meg szeretnéd ismerni a matematikai hátterét ezeknek az egyenleteknek, akkor ajánlom figyelmedbe az alábbiakat:

Felhasznált irodalom

http://kkft.bme.hu/sites/default/files/Vebi_Biomernoki.pdf

http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372817/pdf/microrev00033-0134.pdf

https://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth

Error thrown

Call to undefined function profitmag_categorized_blog()

Related Post