E.coli növekedési paramétereinek meghatározása

Az Escherichia coli (kólibaktérium vagy kólibacilus) egy rövid, Gram-negatív baktérium az Enterobacteriaceae családban, az Escherichia nemzetség legismertebb faja. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan is. Aerob, fakultatív anaerob.

Gyakorlati megközelítés

Az egyetemen sokszor elméleti oldaláról közelítjük meg a gyakorlatban amúgy sokkal érthetőbben demonstrálható kérdéseket. Az alábbiakban összegyűjtöttem a legfontosabb gyakorlati lépéseket, amivel könnyedén meghatározhatjuk, jelen esetben az E.coli-ra jellemző növekedési paramétereket.

OD600 (optical density) – Sejtkoncentrációt kifejező érték. Viszonyszám, mértékegysége nincs. 0 tól akár több száz is lehet. Egy OD600 érték  körülbelül 8 x 10sejt/ml értéknek felel meg.

Sejtszám – OD értékből számolható. [db]

Generációs idő –  az az idő, ami alatt a biomassza tömege a 2 szeresére nő.

Növekedési ráta – Az egyed szám időegység alatti növekedését mutatja.

Generációk száma – Optimális környezetben a sejtszám időegység alatt megduplázódik. 1, 2, 4, 8, stb. vagy 20, 21, 22, 23………2n (ahol n = generációk száma)

Mindez a gyakorlatban

A baloldalon agar minimál médiumon tenyésztett e-coli látható, szépen elkülönült telepekkel. Ezekből kiválasztunk egyet oltókaccsal felvesszük, a jobb oldalon látható falcon csőben lévő médiumba elszuszpendáljuk, majd rázó inkubátorba tesszük (28-33oC) éjszakára.

colony

falcon tube

Ha mindent jól csináltunk akkor reggelre egy zavaros oldatot kapunk, ennek megmérjük az optikai sűrűségét. 100μL kiveszünk, 900μL izotóniás sóoldattal hígítjuk (10x hígítás), majd spektrofotométerrel 600nm-en megmérjük az OD-t. OD600 = mért érték * hígítás, ez többnyire 1-2,5 érték között lesz.

Ebben az esetben az OD = 2.00

Képek

Ebből az oldatból 2-2ml-t 18-18ml friss médiumba oltunk (10x), az egyik 28oC-ra másikat 33oC-ra tesszük. Óránként mérjük az OD600 értéküket. Az értékeket grafikonon ábrázoljuk.

 Idő [h]  OD600  Sejtszám  log(sejtszám)

33oC 〈〉 28oC

 OD600  Sejtszám  log(sejtszám)
0 0,2 160000000 8,20412 0,2 160000000 8,20412
1,17 0,3 240000000 8,380211 0,25 200000000 8,30103
2,33 0,4 320000000 8,50515 0,4 320000000 8,50515
3,33 0,7 560000000 8,748188 0,55 440000000 8,643453
4,33 1,1 880000000 8,944483 0,8 640000000 8,80618
5,17 1,6 1,28E+09 9,10721 1,05 840000000 8,924279

OD600 az idő függvényében.

e.coli növekedési ráta

Az y tengely bal oldalán a sejtszám logaritmusa, a jobb oldalon a sejtszám van ábrázolva.

Semilogarithmic scale

Generációs idő

G = t/(3,3log(N/N0))

Ahol:

28oC 330C
G = generációs idő [h] 2,18 1,73
t = két mintavétel között eltelt idő [h] 5,17 5,17
N = Időintervallum végén mért OD 1,05 1,6
N0 = Időintervallum kezdetén mért OD 0,2 0,2

Látható, hogy 33 0C-on gyorsabban nőnek a sejtek.

 

Növekedési ráta

μ = ln(N/N0)/t

28oC 330C
μ = Növekedési ráta h-1 0,32 0,40
t = két mintavétel között eltelt idő [h] 5,17 5,17
N = Időintervallum végén mért OD 1,05 1,6
N0 = Időintervallum kezdetén mért OD 0,2 0,2

 

Generációk száma

n = t/G

28oC 330C
n = Generációk száma 2,37 2,99
t = két mintavétel között eltelt idő [h] 5,17 5,17
G = generációs idő [h] 2,18 1,73

 

Számolási feladat

Van egy kiindulási sejtenyészetünk OD600 =2,00. A fentiekben meghatároztuk a jellemző paramétereit. Az a feladatunk, hogy ebből egy éjszakás tenyészetet indítsunk, aminek az OD600 értéke reggelre 2,5 kell legyen, ez 17 órát jelent. A tenyészetet 280C-os  inkubátorba tesszük, a térfogata pedig 20mL. Ezzel fogjuk majd inokulálni (beoltani) a 2L-es fermentorunkat.

N = N0 * eμ*t

Amit ismerünk ebből:

N = 2,5

μ = 0,32h-1

t = 17h

Átrendezve az egyenletet:

N0 =  N/eμ*t = 2,5 / e0,32*17 = 0,0108 ∼ 0,011

Tehát a 20mL médiumhoz annyi ml OD: 2,00 inoculumot kell adni, hogy a kezdeti OD értéke 0,011 legyen. Ez így ránézésre kb. 200-szoros hígítást jelent.

Pontos értéket egy egyszerű hígítási egyenlettel ki tudjuk számolni (ahol X1 OD:2,00 inokulum millilitereinek a száma):

X1 * 2 = 20ml * 0,011, X= 0,11ml

Ahhoz tehát, hogy a kezdeti OD értéket 0,011 re állítsuk be, a 20ml kiindulási oldatunkhoz 0,11ml (OD:2,00) inokulumot kell adnunk, ami 182,82 szeres hígítást jelent.

A számításhoz használhatod az online kalkulátort is:

http://weblaboratorium.hu/html/2.php

Ha jobban meg szeretnéd ismerni a matematikai hátterét ezeknek az egyenleteknek, akkor ajánlom figyelmedbe az alábbiakat:

Felhasznált irodalom

http://kkft.bme.hu/sites/default/files/Vebi_Biomernoki.pdf

http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372817/pdf/microrev00033-0134.pdf

https://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth

 

Share This:

 
Loading Facebook Comments ...

Leave a Comment