Az Escherichia coli (kólibaktérium vagy kólibacilus) egy rövid, Gram-negatív baktérium az Enterobacteriaceae családban, az Escherichia nemzetség legismertebb faja. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan is. Aerob, fakultatív anaerob.
Gyakorlati megközelítés
Az egyetemen sokszor elméleti oldaláról közelítjük meg a gyakorlatban amúgy sokkal érthetőbben demonstrálható kérdéseket. Az alábbiakban összegyűjtöttem a legfontosabb gyakorlati lépéseket, amivel könnyedén meghatározhatjuk, jelen esetben az E.coli-ra jellemző növekedési paramétereket.
OD600 (optical density) – Sejtkoncentrációt kifejező érték. Viszonyszám, mértékegysége nincs. 0 tól akár több száz is lehet. Egy OD600 érték körülbelül 8 x 108 sejt/ml értéknek felel meg.
Sejtszám – OD értékből számolható. [db]
Generációs idő – az az idő, ami alatt a biomassza tömege a 2 szeresére nő.
Növekedési ráta – Az egyed szám időegység alatti növekedését mutatja.
Generációk száma – Optimális környezetben a sejtszám időegység alatt megduplázódik. 1, 2, 4, 8, stb. vagy 20, 21, 22, 23………2n (ahol n = generációk száma)
Mindez a gyakorlatban
A baloldalon agar minimál médiumon tenyésztett e-coli látható, szépen elkülönült telepekkel. Ezekből kiválasztunk egyet oltókaccsal felvesszük, a jobb oldalon látható falcon csőben lévő médiumba elszuszpendáljuk, majd rázó inkubátorba tesszük (28-33oC) éjszakára.
|
|
→ |  |
Ha mindent jól csináltunk akkor reggelre egy zavaros oldatot kapunk, ennek megmérjük az optikai sűrűségét. 100μL kiveszünk, 900μL izotóniás sóoldattal hígítjuk (10x hígítás), majd spektrofotométerrel 600nm-en megmérjük az OD-t. OD600 = mért érték * hígítás, ez többnyire 1-2,5 érték között lesz.
Ebben az esetben az OD = 2.00
Képek
[Best_Wordpress_Gallery id=”49″ gal_title=”shake flask”]
Ebből az oldatból 2-2ml-t 18-18ml friss médiumba oltunk (10x), az egyik 28oC-ra másikat 33oC-ra tesszük. Óránként mérjük az OD600 értéküket. Az értékeket grafikonon ábrázoljuk.
| Idő [h] | OD600 | Sejtszám | log(sejtszám) |
33oC 〈〉 28oC |
OD600 | Sejtszám | log(sejtszám) |
| 0 | 0,2 | 160000000 | 8,20412 | 0,2 | 160000000 | 8,20412 | |
| 1,17 | 0,3 | 240000000 | 8,380211 | 0,25 | 200000000 | 8,30103 | |
| 2,33 | 0,4 | 320000000 | 8,50515 | 0,4 | 320000000 | 8,50515 | |
| 3,33 | 0,7 | 560000000 | 8,748188 | 0,55 | 440000000 | 8,643453 | |
| 4,33 | 1,1 | 880000000 | 8,944483 | 0,8 | 640000000 | 8,80618 | |
| 5,17 | 1,6 | 1,28E+09 | 9,10721 | 1,05 | 840000000 | 8,924279 |
OD600 az idő függvényében.
Az y tengely bal oldalán a sejtszám logaritmusa, a jobb oldalon a sejtszám van ábrázolva.
Generációs idő
G = t/(3,3log(N/N0))
Ahol:
| 28oC | 330C | |
| G = generációs idő [h] | 2,18 | 1,73 |
| t = két mintavétel között eltelt idő [h] | 5,17 | 5,17 |
| N = Időintervallum végén mért OD | 1,05 | 1,6 |
| N0 = Időintervallum kezdetén mért OD | 0,2 | 0,2 |
Látható, hogy 33 0C-on gyorsabban nőnek a sejtek.
Növekedési ráta
μ = ln(N/N0)/t
| 28oC | 330C | |
| μ = Növekedési ráta h-1 | 0,32 | 0,40 |
| t = két mintavétel között eltelt idő [h] | 5,17 | 5,17 |
| N = Időintervallum végén mért OD | 1,05 | 1,6 |
| N0 = Időintervallum kezdetén mért OD | 0,2 | 0,2 |
Generációk száma
n = t/G
| 28oC | 330C | |
| n = Generációk száma | 2,37 | 2,99 |
| t = két mintavétel között eltelt idő [h] | 5,17 | 5,17 |
| G = generációs idő [h] | 2,18 | 1,73 |
Számolási feladat
Van egy kiindulási sejtenyészetünk OD600 =2,00. A fentiekben meghatároztuk a jellemző paramétereit. Az a feladatunk, hogy ebből egy éjszakás tenyészetet indítsunk, aminek az OD600 értéke reggelre 2,5 kell legyen, ez 17 órát jelent. A tenyészetet 280C-os inkubátorba tesszük, a térfogata pedig 20mL. Ezzel fogjuk majd inokulálni (beoltani) a 2L-es fermentorunkat.
N = N0 * eμ*t
Amit ismerünk ebből:
N = 2,5
μ = 0,32h-1
t = 17h
Átrendezve az egyenletet:
N0 = N/eμ*t = 2,5 / e0,32*17 = 0,0108 ∼ 0,011
Tehát a 20mL médiumhoz annyi ml OD: 2,00 inoculumot kell adni, hogy a kezdeti OD értéke 0,011 legyen. Ez így ránézésre kb. 200-szoros hígítást jelent.
Pontos értéket egy egyszerű hígítási egyenlettel ki tudjuk számolni (ahol X1 OD:2,00 inokulum millilitereinek a száma):
X1 * 2 = 20ml * 0,011, X1 = 0,11ml
Ahhoz tehát, hogy a kezdeti OD értéket 0,011 re állítsuk be, a 20ml kiindulási oldatunkhoz 0,11ml (OD:2,00) inokulumot kell adnunk, ami 182,82 szeres hígítást jelent.
A számításhoz használhatod az online kalkulátort is:
http://weblaboratorium.hu/html/2.php
Ha jobban meg szeretnéd ismerni a matematikai hátterét ezeknek az egyenleteknek, akkor ajánlom figyelmedbe az alábbiakat:
Felhasznált irodalom
http://kkft.bme.hu/sites/default/files/Vebi_Biomernoki.pdf
http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372817/pdf/microrev00033-0134.pdf
https://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth