Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Az RFLP módszer ismert mutáció kimutatására alkalmas. A vizsgálat azon alapul, hogy a mutáció vagy megszünteti, vagy generálja egy restrikciós enzim felismerési helyét. Hinf I enzim felismerési szekvenciája GANTC (ahol N bármelyik bázis lehet) és a hasítási helye G és A között van.

Vegyünk példának egy kitalált szekvenciát (amiben GANTC szerepel):

AAAGGGCCGCGTGCATTATATAGANTCATATATAT

Jelöljük ki, majd másoljuk a vágólapra (Ctrl C), menjünk a NEB oldalára, ahol a NEBcutter V2.0 program(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php ) segítségével leellenőrizzük, hogy az enzimünk tényleg ott hasít-e. Ctrl V kombinációval beillesztjük a szekvenciát a nagy dobozba majd a submit gombra kattintva, a következő kép jelenik meg előttünk (ha az egeret a Hinf I feliratra visszük piros vonal jelzi a felismerési szekvenciát, a hasítási helyet a kék nyíl jelzi):

 Hinf I enzim hasit

Tehát ha a GANTC szekvencia megtalálható a génben a Hinf I felismeri és a G után elhasítja.

Szorgalmi feladat

Kattintsunk a custom digest opcióra, majd válasszuk ki a kívánt enzimet (estünkben Hinf I), majd a zöld digest gombra kattintva most már csak a kívánt enzimünk hasítási képe látszik. Ha szeretnénk megnézni, hogy ez hogy néz ki a futtatás után akkor katt a view gel gombra.

Ha a Gel Type: 1% agarose, a Marker: 100bp DNA Ladder beállításokat használod a következő képet fogod látni:

futtatas

A baloldali sok vonal a DNS létra (100bp-1517bp), a jobb oldali az emésztett DNS-ünk. A futtatás fentről lefelé történt. A futtatási kép alapján nem tudnánk megmondani mekkora fragmentumokat kaptunk, de a program ezt is kiszámolja nekünk (az alsó 12bp, a felső 23bp hosszúságú).
És végül állapítsuk meg hogy a kitalált szekvenciánk hasítás után olyan kicsik, hogy agaróz gélen nem választhatók el, de ha el is válnának olyan gyenge a festődésük, hogy nem látnánk semmit.
A még  hatékonyan elválasztható tartomány 2%-os agarózban 0,1-2kb.

Hogy tudunk elválasztani ilyen kis szekvenciákat?

Ha a GANTC szekvenciánk nukleotid szubsztitúció következtében GANTT-re változik (C –> T) az enzim nem tud bekötődni, a hasítás nem jön létre. A kitalált génünket alakítsuk a következő képen (ebben GANTT szerepel):

AAAGGGCCGCGTGCATTATATAGANTTATATATAT

Végezzük el az így módosított szekvenciánkkal az előbbiekben ismertetett metódust és nézzük meg, hogy a Hinf I endonukleáz hasít-e.

Szorgalmi feladat

Látogassunk el a http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp?#2 oldalra, keressük ki a Hinf I enzimet és tanulmányozzuk át amit írnak róla.

Az RFLP alkalmazási területei, Southern blot analízis

A Southern blot analízissel a genomiális DNS restrikciós enzimmel darabolt fragmentjeit azonosítjuk és következtetünk a mutációra.

Agaróz gél elektroforézis 

0,7%-os agaróz gélben TBE pufferrel. Az elektroforézis lehetőleg lassú legyen, az ajánlott feszültség gradiens < 1V/cm. Elektroforézis után ellenőrizzük a sávokat (ethidium bromiddal festett) UV alatt.
A gél max. 1 napig tárolható +40C-on, utána sávszélesedés történik.

A DNS transzfere (blotting)

Az agaróz gélben lévő DNS-t szilárd hordozóra visszük át (membrán: nylon, nitrocellulóz). A trenszfer előtt a DNS-t egyszálasítjuk –> lúgos fürdő.
A blottolást többféleképpen végezhetjük, a leggyakrabban használt a kapilláris módszer.

A DNS fixálása a membránon

Vákuumban és magas hőmérsékleten (800C) 30-120 percig, vagy UV fénnyel, de a legújabb membránokra már a transzfer alatt kötődik.

Előhibridizáció  (Pre-hybridization)

Célja a próba (DNS) kötődésének megakadályozása a membránon a nem specifikus helyekre (pl. lazac sperma DNS, vagy élesztő DNS-el). A specifikus helyek a próba komplementer szekvenciáját tartalmazó DNS sávok.

A DNS próba (szonda)

A próba a meghatározandó DNS komplementer szekvenciáját tartalmazó 0,5-5kb nagyságú DNS szakasz. A próba DNS csak szigorúan meghatározott helyre tud bekötődni.  A próbát a hibridizáció előtt jelöltük, ami a keresett DNS és a próba hibridjét/komplexét azonosítani fogja.

Hibridizáció

Ebben a lépésben a meghatározandó DNS-ünk a vele komplementer próbával hibridet képez. Ezt a lépést egy speciális eszközben a hibridizátorban végezzük, ami biztosítja a kívánt hőmérsékletet és a folyamatos homogenizálást. A hibridizációt 40-700C-on végezzük, 20-250C-kal a TM alatt. A hibridizáció után mosással eltávolítjuk a nem kötődött próbát. A mosást többször végezzük a folyadék ionerősségének fokozatos csökkentésével.

Detektálás és értékelés

A target DNS jelölt próba hibridet a membránon ezután különböző módszerrel láthatóvá tesszük. A radioaktívan jelölt próbánál autoradiográfiát alkalmaztak (ezt az eljárást már egyre kevesebb helyen használják), újabban a kemilumineszcenciás módszerek gyakoribbak.

Share This:

 
Loading Facebook Comments ...

Leave a Comment