Az RFLP módszer ismert mutáció kimutatására alkalmas. A vizsgálat azon alapul, hogy a mutáció vagy megszünteti, vagy generálja egy restrikciós enzim felismerési helyét. Hinf I enzim felismerési szekvenciája GANTC (ahol N bármelyik bázis lehet) és a hasítási helye G és A között van.
Vegyünk példának egy kitalált szekvenciát (amiben GANTC szerepel):
AAAGGGCCGCGTGCATTATATAGANTCATATATAT
Jelöljük ki, majd másoljuk a vágólapra (Ctrl C), menjünk a NEB oldalára, ahol a NEBcutter V2.0 program(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php ) segítségével leellenőrizzük, hogy az enzimünk tényleg ott hasít-e. Ctrl V kombinációval beillesztjük a szekvenciát a nagy dobozba majd a submit gombra kattintva, a következő kép jelenik meg előttünk (ha az egeret a Hinf I feliratra visszük piros vonal jelzi a felismerési szekvenciát, a hasítási helyet a kék nyíl jelzi):
Tehát ha a GANTC szekvencia megtalálható a génben a Hinf I felismeri és a G után elhasítja.
Szorgalmi feladat
Kattintsunk a custom digest opcióra, majd válasszuk ki a kívánt enzimet (estünkben Hinf I), majd a zöld digest gombra kattintva most már csak a kívánt enzimünk hasítási képe látszik. Ha szeretnénk megnézni, hogy ez hogy néz ki a futtatás után akkor katt a view gel gombra.
Ha a Gel Type: 1% agarose, a Marker: 100bp DNA Ladder beállításokat használod a következő képet fogod látni:
A baloldali sok vonal a DNS létra (100bp-1517bp), a jobb oldali az emésztett DNS-ünk. A futtatás fentről lefelé történt. A futtatási kép alapján nem tudnánk megmondani mekkora fragmentumokat kaptunk, de a program ezt is kiszámolja nekünk (az alsó 12bp, a felső 23bp hosszúságú).
És végül állapítsuk meg hogy a kitalált szekvenciánk hasítás után olyan kicsik, hogy agaróz gélen nem választhatók el, de ha el is válnának olyan gyenge a festődésük, hogy nem látnánk semmit.
A még hatékonyan elválasztható tartomány 2%-os agarózban 0,1-2kb.
Hogy tudunk elválasztani ilyen kis szekvenciákat?
Ha a GANTC szekvenciánk nukleotid szubsztitúció következtében GANTT-re változik (C –> T) az enzim nem tud bekötődni, a hasítás nem jön létre. A kitalált génünket alakítsuk a következő képen (ebben GANTT szerepel):
AAAGGGCCGCGTGCATTATATAGANTTATATATAT
Végezzük el az így módosított szekvenciánkkal az előbbiekben ismertetett metódust és nézzük meg, hogy a Hinf I endonukleáz hasít-e.
Szorgalmi feladat
Látogassunk el a http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp?#2 oldalra, keressük ki a Hinf I enzimet és tanulmányozzuk át amit írnak róla.
Az RFLP alkalmazási területei, Southern blot analízis
A Southern blot analízissel a genomiális DNS restrikciós enzimmel darabolt fragmentjeit azonosítjuk és következtetünk a mutációra.
Agaróz gél elektroforézis
0,7%-os agaróz gélben TBE pufferrel. Az elektroforézis lehetőleg lassú legyen, az ajánlott feszültség gradiens < 1V/cm. Elektroforézis után ellenőrizzük a sávokat (ethidium bromiddal festett) UV alatt.
A gél max. 1 napig tárolható +40C-on, utána sávszélesedés történik.
A DNS transzfere (blotting)
Az agaróz gélben lévő DNS-t szilárd hordozóra visszük át (membrán: nylon, nitrocellulóz). A trenszfer előtt a DNS-t egyszálasítjuk –> lúgos fürdő.
A blottolást többféleképpen végezhetjük, a leggyakrabban használt a kapilláris módszer.
A DNS fixálása a membránon
Vákuumban és magas hőmérsékleten (800C) 30-120 percig, vagy UV fénnyel, de a legújabb membránokra már a transzfer alatt kötődik.
Előhibridizáció (Pre-hybridization)
Célja a próba (DNS) kötődésének megakadályozása a membránon a nem specifikus helyekre (pl. lazac sperma DNS, vagy élesztő DNS-el). A specifikus helyek a próba komplementer szekvenciáját tartalmazó DNS sávok.
A DNS próba (szonda)
A próba a meghatározandó DNS komplementer szekvenciáját tartalmazó 0,5-5kb nagyságú DNS szakasz. A próba DNS csak szigorúan meghatározott helyre tud bekötődni. A próbát a hibridizáció előtt jelöltük, ami a keresett DNS és a próba hibridjét/komplexét azonosítani fogja.
Hibridizáció
Ebben a lépésben a meghatározandó DNS-ünk a vele komplementer próbával hibridet képez. Ezt a lépést egy speciális eszközben a hibridizátorban végezzük, ami biztosítja a kívánt hőmérsékletet és a folyamatos homogenizálást. A hibridizációt 40-700C-on végezzük, 20-250C-kal a TM alatt. A hibridizáció után mosással eltávolítjuk a nem kötődött próbát. A mosást többször végezzük a folyadék ionerősségének fokozatos csökkentésével.
Detektálás és értékelés
A target DNS jelölt próba hibridet a membránon ezután különböző módszerrel láthatóvá tesszük. A radioaktívan jelölt próbánál autoradiográfiát alkalmaztak (ezt az eljárást már egyre kevesebb helyen használják), újabban a kemilumineszcenciás módszerek gyakoribbak.
Error thrown
Call to undefined function profitmag_categorized_blog()