Ammónium-ion koncentráció mérése salicylate-cyanurate eljárással

Reagensek összetétele

Reagens 1: Sodium salicylate 120 g/L
Sodium citrate 120 g/L
Sodium nitroprussiate * 2 H2O 0.925 g/L
Reagens 2: Sodium hydroxide 32 g/L
Dichloroisocyanuric acid Sodium salt * 2 H2O 2 g/L

 

Alkalmazási területek

Ezt az eljárást fermentlé ammónium-ion tartalmának meghatározásához használtam, de természetesen vizek, tápoldatok mérésére is kiválóan alkalmazható.

Az E.coli fermentációknál fontos ismerni az ammónium-ion koncentrációját, mivel a sejtek ebből építik fel aminosavaikat, DNS, RNS, stb. állományukat. Ennek hiányában nem képesek tovább osztódni és természetesen, ha pl. valamilyen fehérje vagy aminocukor a kívánt termék, amit termeltetünk velük, akkor ezek színtézise is megáll. A túl nagy koncentrációban jelenlévő ammónium-ion szintén károsan befolyásolja a sejtek növekedését és a termeltetett célfehérje, szénhidrát koncentrációja is csökken. Ha csak közelítőleg akarjuk meghatározni az ammónium koncentrációt akkor használhatunk gyorstesztet. Katt ide!

 

A recept

  • Eppendorf csőben centrifugáljunk le 1mL fermentlevet 14.000-es fordulaton 12percig
  • A felülúszót (supernatant) hígítsuk meg desztillált vízzel, hogy a koncentráció 0 és 50mg/L közé essen
    (ebben az esetben 200x-es hígítás volt a megfelelő, de ez ugye erősen függ a körülményektől)
  • 50uL mintát és 100-100µL reagens 1-et és 2-őt belepipettázzuk egy küvettába és 15percig állni hagyjuk. A zöld szín erősödése jelzi az ammónium-ion jelenlétét.
  • 15perc eltelte után 1,5mL desztillált vízzel meghígítjuk, majd mérjük az abszorbanciát 658nm-en

A kalibrációs sorozat elkészítése

A kalibrációs sorozat elkészítéséhez ammónium szulfátot használunk (használható egyéb ammónium só is, pl. klorid, vagy hidrogén foszfát). Első lépésben készítünk egy kb. 0,5g/L koncentrációjú törzsoldatot, amit a megfelelő értékekre hígítunk, leaf graphichogy az egyes törzsoldatok koncentrációja 5,10,15,30,50,mg/L legyen ammónium szulfátra nézve. Ezeknek az abszorbancia értékeit és moláris koncentrációit az alábbi táblázat tartalmazza és a jobboldali grafikonon ábrázolva is láthatjuk.

(NH4)2SO4 µM NH4+ Absorption at 658nm
5mg 75,55 0,0487
10mg 151,11 0,0929
15mg 227,22 0,1323
30mg 453,88 0,2782
50mg 756,66 0,4415

Az alábbi táblázat tartalmazza a leolvasott abszorbancia értékekhez tartozó koncentrációkat. Pl. az első mintában a mért abszorbancia 0,0652, az ehhez tartozó koncentráció érték 103,54 µM/L. A mintát, úgy készítettem, hogy 0,5mL fermentléhez 1mL vizet adtam, majd 20percig 100oC-on tartottam, hogy a sejten belüli ammónium-ionok kiszabadulhassanak,  tehát ez egy 3-szoros hígítás. Centrifugálás után a felülúszóból 50µL-t 10mL-re hígítottam egy mérőlombikba, ez tehát egy további 200-szoros hígítás. Így kaptuk az átszámítási faktort, ami (103,54*200*3)/1000000. Az egymilliós osztás a µM –> M átszámítás miatt kell.

Az egyes abszorbancia értékekhez tartozó koncentrációk

Minta fermentáció
Minta Idő (h) OD Abszorbancia 658nm-en NH4+ µM higított mintában Koncentráció [mol/L] Koncentráció [g/L]
1. 22 51,53 0,0652 103,5348 0,062121 1,118176
2. 41,53 98,62 0,0516 80,17388 0,048104 0,865878
3. 46,08 105,02 0,0543 84,81171 0,050887 0,915966
4. 65,42 131,3 0,0797 128,4416 0,077065 1,38717
5. 70,33 136,48 0,0761 122,2579 0,073355 1,320385
6. 94,67 150,98 0,0905 146,993 0,088196 1,587524
7. 114,33 199,44 0,0994 162,2806 0,097368 1,752631
8. 137,17 174,92 0,11 180,4884 0,108293 1,949275

Excel file letöltése

excel ikon

Share This:

 
Loading Facebook Comments ...

COMMENTS

Leave a Comment